CRAN - Campus Sciences
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Sujet de Thèse : Caractérisation du mécanisme d’action de la protéine DDB2 dans la transcription de gènes cibles impliqués dans la carcinogenèse mammaire et dans la résistance aux thérapies.
Dates : 2014/10/01 - 2018/08/31
Etudiant : GUILLAUME DROUOT
Directeur(s) CRAN : Philippe BECUWE , Nadège TOUCHE
Description : I. Contexte scientifique
Le travail de notre équipe consiste à identifier de nouveaux marqueurs moléculaires impliqués dans le développement des adénocarcinomes mammaires et/ou dans l’échappement aux thérapies anticancéreuses.
Notre équipe a mis en évidence la surexpression de la protéine Damaged DNA Binding 2 (DDB2) dans les tumeurs mammaires les moins agressives et dans certaines lignées de cellules tumorales sensibles aux œstrogènes. A contrario, dans les lignées de cellules insensibles aux œstrogènes et à fort pouvoir métastatique, DDB2 est faiblement exprimée. Nous avons montré que DDB2 active la prolifération de cellules tumorales mammaires sensibles aux œstrogènes en réprimant l’activité transcriptionnelle du gène codant la superoxyde dismutase mitochondriale (SOD Mn) par sa fixation sur une séquence identifiée dans son promoteur. Une surexpression de DDB2 réduit très significativement les capacités migratrices et invasives des lignées de cellules d’adénocarcinome mammaire MDA-MB231 etSKBR3.
Une analyse sur puce transcriptomique pangénomique a révélée que l’inhibition de l’expression de DDB2 est associée à celle de 664 gènes et à l’activation d’environ 800 autres. Parmi ces gènes figure celui codant la protéine IBα, l’inhibiteur cytoplasmique de NFB. Ce dernier, constitutivement actif dans les cellules tumorales n’exprimant pas le récepteur aux œstrogènes, serait impliqué dans leurs capacités invasives. Nous avons démontré que DDB2 est un régulateur positif de l’expression du gène codant IBα. DDB2 exerce son action en se liant sur le promoteur de ce gène à une séquence similaire à celle trouvée dans le promoteur SODMn . Des expériences de mutagénèse dirigée et transfection transitoire sur la séquence cible de DDB2 dans des lignées de cellules cancéreuses mammaires surexprimant ou non la protéine DDB2 ont permis de montrer l'importance de ce site.
Dans le but d’identifier les séquences géniques sur lesquelles la protéine DDB2 est susceptible de se fixer, nous avons réalisé une expérience de ChIP à l’aide d’un anticorps dirigé contre la protéine DDB2 suivit d’un séquençage des fragments immunoprécipités (ChIP-SEQ). Les résultats bruts ont révélés plus de 1200 séquences différentes. L’analyse de ces séquences nous a permis d’identifier plusieurs cibles ayant un intérêt tout particulier dans le cadre de notre étude. Cependant les séquences identifiées ne correspondent pas à des promoteurs.
II. Hypothèse et objectifs
Nous avons montré les conséquences sur l’expression d’IBα et de la SODMn lorsque DDB2 est fixée sur les promoteurs de ces gènes. Cependant, l’activité réelle de cette protéine DDB2 dans la régulation de la transcription n’est pas clairement définie. Notre hypothèse de travail est qu’elle favoriserait le recrutement de facteurs de transcription, comme montré pour le gène de la SOD Mn ou interagirait avec des partenaires protéiques restant à identifier.
L’objectif de ce projet sera d’identifier les partenaires protéiques de DDB2, sur les promoteurs des gènes codant IBα et SODMn et sur les séquences géniques non promotrices précédemment identifiées au laboratoire par ChIP-SEQ. Nous préciserons le mode d’interaction de ces protéines. D’autre part, DDB2 étant impliquée dans la réparation de l’ADN (réparation NER), nous étudierons l’influence d’une irradiation UV sur sa fonction de régulation de la transcription.
III. Développement méthodologique du projet
La recherche des partenaires de DDB2sur ses séquences géniques cibles s’appuie sur la technique de DNA pull down, et sur des techniques d’immunoprécipitation (IP),de ChIP et d'EMSA. La technique de DNA pull down consiste à piéger la protéine DDB2 ainsi que ses partenaires potentiels à l’aide d’un oligonucléotide contenant sa séquence connue de fixation. Cet oligonucléotide biotinylé, ayant piégé les protéines, est ensuite capturé par affinité sur des billes magnétiques couplées à la streptavidine. Un contrôle négatif est réalisé avec un oligonucléotide comportant la séquence cible de DDB2 mutée. Les protéines associées à DDB2 seront identifiées par une analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse.
Les protéines partenaires de DDB2 seront recherchées dans des extraits nucléaires préparés à partir des cellules des lignées cancéreuses mammaires exprimant ou non la protéine DDB2.
A partir des résultats obtenus, nous confirmerons l’interaction de DDB2 avec les protéines identifiées par d’autres approches méthodologiques telles que la ChIP, l’IP et l'EMSA.
Nous caractériserons ensuite les interactions de la protéine DDB2 avec son/ses partenaire(s) protéique(s). Cette étude nécessitera la production de protéine DDB2 mutée portant un tag. Nous délèterons chacun des domaines WD40 et le domaine Hélice-boucle-hélice par lequel DDB2 interagit avec la protéine DDB1 pour former le complexe UV-DDB au cours de la réparation NER. Nous analyserons les capacités de liaison de DDB2 muté avec son/ses partenaire(s).
Enfin nous étudierons l’influence d’une irradiation UV (en particulier UVC qui induisent essentiellement des lésions CPD et 6-4PP) sur les différentes lignées de cellules cancéreuses mammaires disponibles au laboratoire. Nous évaluerons, par la méthode de gène rapporteur, l’effet de ces irradiations sur la transcription des promoteurs cibles (NFKBIA et SODMn). Nous étudierons également le recrutement de la protéine DDB2 sur ses séquences cibles par ChIP.
IV. Faisabilité du projet
La réalisation de ce projet nécessite la mise au point des conditions expérimentales de la technique de « DNA pull down», ce qui constitue le sujet de M2R de Guillaume DROUOT. Les approches (ChIP, IP et EMSA) permettant de vérifier les résultats obtenus par « DNA pull down» sont couramment utilisées dans le laboratoire et les modèles cellulaires et les plasmides sauvages et mutés pour la réalisation de ce projet ont déjà été produits au laboratoire. L’étude de l’influence d’une irradiation UV sur la fonction de régulation de la transcription de DDB2 sera menée en partenariat avec une entreprise locale (BASF) basée à Pulnoy.
VI. Retombées attendues
Nous espérons mieux comprendre comment DDB2 intervient dans la transcription génique. ce qui pourra conduire à la mise en évidence de marqueurs d’intérêt clinique, voire de cibles thérapeutiques potentielles.
Mots clés :
Département(s) :
Santé - Biologie - Signal